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        細胞系錯誤鑒定:終結的開始
        時間:2015-12-15 來源:www.bajurtov.com 瀏覽:31073

        2010年5月ATCC SDO(Standards Development Organization)工作組在Nature review cancer雜志上發表了題為《Cell line misidentification:the beginning of the end》前瞻性報道。以下是全文內容。

        摘要:

        細胞系作為正?;蚰[瘤組織的模式細胞被廣泛應用于科學研究和藥物開發,然而很大一部分的細胞系被錯誤標記或被其它個體、組織真人网上投注平台、種系來源的細胞所替代,由于科學界無法解決此類問題以致大量因使用錯誤鑒定的細胞系而導致誤導或存在潛在錯誤的學術論文發表。通過近年來的努力而開發出的STR分型方法已成為對人源細胞進行鑒定的標準方法,STR分型的應用成為根除細胞錯誤鑒定這一問題的重要一步。

        細胞系作為體外模型而被廣泛應用于生物醫學研究。正確數據的獲得常常依賴于細胞系的特性,尤其是當它用來替代其來源者的組織時真人网上投注平台。令人感到驚訝的是,細胞錯誤鑒定的發生率卻不低真人网上投注平台,以致原來把某一細胞歸為另一細胞系的來源者通常都是錯誤的?。細胞錯誤鑒定問題已有50年歷史,基于國際細胞庫的分析數據顯示:1977年細胞錯誤鑒定率為16%,1999年為18%,直到最近幾年真人网上投注平台,應用于生物醫學領域的細胞系需要鑒定的問題仍然很少有人關注。于是ATCC標準開發組織工作組ASN-0002(SDO,一個目前正在開發人類細胞系鑒定標準的工作組)成員寫了這篇科學與社會文章。ATCC SDO成立于2007,旨在開發最好的應用于生命科學的標準真人网上投注平台,及使用一致的工序來平衡工業界、政府、協調部門和學術界的意見。我們期望此標準草案能夠在2010年得到公眾的審查和評論,隨后,最終草案被美國國家標準研究院(ANSL)批準。

        這里我們描述了細胞錯誤鑒定形成的原因、給科學界帶來的影響和歷史真人网上投注平台、,以及為解決此問題所做的努力真人网上投注平台。我們討論了目前能用于細胞鑒定的不同方法并推薦使用STR分型來鑒定人類細胞系?;蛟S因為其重要性,一個通用的STR分型數據庫正在建設當中。

        細胞錯誤鑒定的發現

        人類和動物細胞培養物的錯誤鑒定是一個長期的問題,最初意識到此問題可追溯到上世紀50年代。核型分析和免疫學方法最先被應用于細胞鑒定,當大量的種系錯誤鑒定被報道后,促使ATCC在1962年建立細胞系鑒定庫。

        種內的細胞在1962年還不能鑒別,到1966年Stanley Gartler引入生化多態性的概念來對人類細胞進行鑒別(基于同工酶的表達)。1966年,在關于細胞、組織及器官培養的第二個十年回顧會議上真人网上投注平台,Gartler報道了這樣一個現象:據推測來源于18個獨立個體的細胞系卻全是Hela細胞(Hela細胞為人類第一個被建立的細胞系),例如包括來源于正常腸上皮細胞(Int-407)、正常羊膜細胞(WISH)真人网上投注平台、正常肝細胞(Chang liver)、喉癌(Hep-2)和口腔癌(KB)。Hela細胞來源于一位名叫Henrietta Lacks的宮頸腺癌患者,由于Hela細胞享有非凡的地位所以它被分派至世界各地,流行于各實驗室之間。因此,直到如今真人网上投注平台,許多科學家都還未察覺到Hela細胞存在與其它細胞發生交叉污染的可能性真人网上投注平台。Hela細胞具體極強和快速的生長能力,由于生長過快以致它會很快抑制其它細胞的生長真人网上投注平台。

        否認和自滿

        對于Gartler的發現,一些人甚至那些應該知道更多的科學家們都表現出了抵制和敵對的態度,但是有一位科學家Walter Nelson-Rees,對Gartler的話引起了特別注意。Nelson-Rees承包了一家從屬于國家腫瘤研究院的細胞庫,他與同事們開發出一種利用核型分析來對細胞進行鑒定的方法真人网上投注平台,他在一系列發表的文章中指出:在送至細胞庫的培養物中真人网上投注平台,據稱為一個獨特的細胞培養物里面卻存在大量的交叉污染,Nelson-Rees的工作表明,由Hela細胞引起的交叉污染極為普遍,甚至經過多年后所有的細胞系都可能被懷疑是Hela細胞,除非可以證明它不是。Nelson-Rees不僅在科學文獻中提出需要注意交叉污染問題,他還通過信函通知受此問題影響的科學家真人网上投注平台。Nelson-Rees對細胞鑒定最后的貢獻于2009年發表(逝世后不久)。

        當Nelson-Rees第一次公布他的發現時,一些科學家根本不予理睬甚至否認他的證據真人网上投注平台,并繼續發表包含錯誤信息的學術論文。結果,Nelson-Rees在想不出任何辦法下只得對使用了污染細胞系的論文或個人進行了標注。在那個時代(也許今天),Nelson-Rees的行為被認為是非科學的,他受到了許多同僚的攻擊。他將自己標榜為治安維持會會員,1981年,NIH終止了與他的合同真人网上投注平台。自從那以后,細胞錯誤鑒定現象愈演愈烈,問題逐步擴大。接下來的10至20年內,細胞庫分發了許多錯誤命名的細胞。

        評估由交叉污染或細胞錯誤鑒定而產生多少誤導性和錯誤的研究是困難的。從1969到2004年,錯誤鑒定培養物的使用在PubMed數據庫中增加了大約10倍,而使用培養細胞發表的論文僅增加了2-2.5倍。到2004年,Hela細胞只是冰山一角,許多其他細胞系在不同“外衣的偽裝”下盛行于世界各地實驗室。

        一項針對正在從事細胞培養的工作人員調查顯示:483例被調查者中,32%使用了Hela細胞,9%的人在不知情下使用了Hela污染物,只有33%的調查者對他們使用的細胞進行了鑒定。35%的人獲得細胞的途徑是其他實驗室真人网上投注平台,而不是大的細胞庫。

        在過去的超過50年的時間,對于細胞錯誤鑒定問題,盡管有人會自鳴得意,并在一些情況下人們最初的反應為否定,但仍有一小部分的人致力于補救此問題。在個人努力中其中占大部分的是相關人員寫信給編輯要求審稿人注意細胞錯誤鑒定問題,以及要求作者提供證據以證明在研究中使用的細胞系既沒有交叉污染也不是錯誤鑒定的細胞。但這些努力在Nelson-Rees的合同終止后大部分都被忽視了,盡管當時DNA指紋識別技術的出現帶來了新的和更多再生的方法,這一技術在90年代初期一再揭示了細胞錯誤鑒定的程度。

        2004年,Roland Nardone開始了第二次的改革運動,他得到了后來成為ATCC 標準制定組織副主席的Joseph B. Perrone的支持,Joseph B. Perrone不僅為他提供了許多的主意,并且還提供了激發這場改革運動的所需要的義憤。與其他相關的科學家一起,Nardone提出了一個全面而相互協調的倡議,以同時尋求引起對此問題本質和重要性的意識和請求受此問題影響的組織和個人的參與,這些組織包括NIH,Howard Hughes醫學院。

        案例和影響

        交叉污染和錯誤鑒定已有一段很長的歷史,這其中有許多的案例真人网上投注平台,我們很難去判斷哪一個是最重要及代價最高的。

        已被描述的經典案例是Hela細胞污染(關于Hela細胞污染有好幾個案例)真人网上投注平台,令人驚奇的是真人网上投注平台,許多被Hela細胞污染的細胞系居然在一些備受尊敬的雜志上仍被使用,而這一使用距離它們最先發現為Hela細胞的時間長達40年之久。

        T24是另外一種生長快速的細胞系真人网上投注平台,它常常污染許多經推測來源于不同膀胱癌的細胞系。EVC304最先被認為是自發轉化的人類正常內皮細胞系,但后來卻發現它是T24膀胱癌細胞系。令人感到意外的是,EVC304不是內皮細胞的這一論述對它作為內皮細胞模型的公開發表幾乎沒多大影響。

        推測來源于人類的前列腺癌細胞系TSU-Pr1和JCA-1也是來源于T24膀胱癌細胞系。這些研究發表在雜志Cancer Research上,但它并不能阻止后來一篇TSU-Pr1作為前列腺癌細胞系模型的研究論文發表在Cancer Research上。

        DNA指紋分析揭示NCI/ADR-RES細胞系實際上為卵巢腫瘤細胞系OVCAR-8真人网上投注平台,而不是乳癌細胞系。大約有300篇已發表的論文使用了錯誤鑒定的NCI/ADR-RES細胞系。NCI/ADR-RES包含在NCI60細胞,兩者STR分型相同。

        1篇描述食管細胞系錯誤鑒定的論文宣稱:基于這些被污染的細胞而產生的實驗結果導致繼續的臨床試驗需招募EAC(食管腺癌)病人,以及需得到超過100多個刊物和至少三個NIH腫瘤研究所的承認真人网上投注平台,還牽涉到11個US專利。

        長達50年的壓制,為什么?

        這里有三大群體需對細胞錯誤鑒定負責:科學家個人、科學期刊真人网上投注平台、資金管理部門。在過去50年大部分時間里,只有科學家個體對此問題提出了抗議。然而要想擺脫許多科學家故意公然使用錯誤鑒定的細胞系這一結論是很難的,再者真人网上投注平台,作者通常會很不情愿發表一項基于使用錯誤鑒定細胞的聲明真人网上投注平台。

        John Maddox,Nature雜志的編輯,在1980年針對引人注目的交叉污染問題寫了一篇評論,標題為“科研工作需為誠信負責”。盡管他對此問題幾乎完全缺乏洞察力,但他提出建議:沒有理由懷疑眾所周知的少數幾個案例在任何意義上只是交叉污染問題的冰山一角。在相同的評論里真人网上投注平台,一些科學家們像Nelson-Rees遭受誹謗真人网上投注平台,因為這篇文章指出:如果這些文明行為(即科研中的誠信問題)遭到自詡為治安團成員的破壞,那么它將成為一場災難真人网上投注平台。細胞系交叉污染的歷史暗示誠信并不像許多科學家們希望相信的它適用于世界各地科學界的那樣真人网上投注平台。

        與此問題相關的科學雜志編輯的回應繼續不斷地得到啟發。數百篇科學雜志文章描述了細胞錯誤鑒定的事例,但直到現在,科學雜志或資金管理部門還沒有采取根除此問題的行動。

        一個很有影響力的組織培養期刊的編輯被邀請考慮將細胞鑒定作為發表論文的必要條件,但他回應說:那將是財政自殺。其它期刊的編輯也拒絕考慮這一質控方案真人网上投注平台,他們認為一旦引進這一發表論文的障礙,那些有意愿投稿至他們雜志的作者人數將會大大減少真人网上投注平台真人网上投注平台。

        在過去的兩年里真人网上投注平台,態度開始發生改變,一些期刊如In Vitro Cellular and Developmental Biology、International Journal of Cancer、Cell Biochemistry 和Biophysics and the American Association for Cancer Research(AACR) journals要求細胞系在發表前需做鑒定。Nature雜志指出:首先基金組織必須要求細胞進行鑒定并提供必要的資金真人网上投注平台。一旦他們這樣做了,Nature將會在文章發表之前要求細胞鑒定。與此同時,基金組織繼續對此問題置之不理。

        基金組織是維持科學標準最有權力的部門,但令人驚奇的是真人网上投注平台,他們拒絕考慮處理甚至不承認細胞錯誤鑒定問題。例如,NIH發表于2007年的通告忽視了科學家個體和審稿人未能解決細胞錯誤鑒定這一問題。一位Nature編輯指出:這一通告只不過讓人強迫接受這一現狀真人网上投注平台。

        一些科學家個人嘗試去解決這一問題,但卻遭遇來自基金部門不予幫助的回應真人网上投注平台,他們要么趨于否認要么將問題弱化。來自Cancer Research UK的一位資深科學家最近的一項聲明提出:細胞錯誤鑒定問題每一年都有抬頭?;鸩糠炙坪跻咽艿竭@個問題的威脅并對試圖解決這一問題的科學家們加以抵抗,另外基金部分對那些試圖尋找解決方案的科學家予以非難以及使他們喪失名譽。

        任何在美國或英國的支持生物醫學研究的主要基金部門本應在過去的10年里面根除細胞系錯誤鑒定問題,而根除這一問題所需經費要少于科學與社會所公布的基金部門提供給每一項目的平均經費。然而,這些基金部門一次又一次地忽略,或是在某些情況下壓制有關這一問題的爭論真人网上投注平台,并且繼續為使用錯誤細胞的研究項目提供資助。有關基金部門對科學進行歪曲和欺騙控制這一角色可能存在更大的牽連真人网上投注平台。

        對于細胞系錯誤鑒定問題不管是期刊還是基金部門都應是無法容忍的。有跡象表明,Nardone的“討伐”運動正在不斷地獲得影響力,并且人類細胞系鑒定的標準將會成為Nardone遺產中一個明確的證據。

        細胞錯誤鑒定的根源

        大部分的細胞系在學術環境中被建立,在學術環境下,組織培養通常被認為是一種對技能少有要求的技術,其所用到的必要設備如流動柜和孵育箱使用起來沒什么限制真人网上投注平台。在這些情況下,嘗試建立一種新的細胞系通常會導致交叉污染是不足為怪的。在送至德國的微生物和細胞培養收藏所的550個個白血病和淋巴瘤細胞系中,59/395(15%)被初創者送來的細胞系以及23/155(15%)的二級來源是錯誤的??梢酝茰y大部分二級來源的細胞系已被交叉污染或被初創者錯誤鑒定真人网上投注平台。

        有許多緣由可以引起細胞培養物錯誤鑒定,每一個實驗室都存在風險?;蛟S細胞錯誤鑒定最直接的原因就是在常規操作過程中對細胞培養容器進行了錯誤標記。造成這種問題出現的原因有:實驗員的工作負荷、缺乏注意以及在細胞操作過程中的分心。

        培養物的交叉污染以及隨后污染細胞的過量生長是另一個引起細胞系錯誤鑒定的常見原因。這種情況發生的幾率在以下條件會增加:試劑的共用、在再喂養操作時反復使用相同的試管、在沒有充分分離每一細胞類型情況下同時對多個培養物進行操作。當交叉污染發生時,一種細胞類型迅速生長而超過另一種,在4-5次細胞傳代后,一個純的污染細胞培養物將會形成。

        在使用其它物種的滋養層(例如小鼠3T3細胞)來繁殖人類干細胞或原始細胞時有意地共培養會導致交叉污染或人類細胞系過生長。正常情況下真人网上投注平台,滋養層細胞處于無增殖狀態,但只要生長抑制程序不完全,它就會不斷繁殖并逐步取代人類細胞。體細胞雜交雖不常見但也會發生,如人類套細胞淋巴瘤細胞系NCEB-1就攜帶了小鼠的七條染色體真人网上投注平台。

        異種移植也會導致細胞系交叉污染和錯誤鑒定,來自異種移植的復蘇細胞會被宿主動物細胞所替代真人网上投注平台。

        一般而言,交叉污染最終的結果將會是少量適應細胞完全且快速的替代。兩個細胞系不能持續共存于同一個培養環境,除非它們是共生關系,但這種情況據我們所知還未有報道。一個細胞群經過許多次傳代后還能包含一個穩定的混合基因組真人网上投注平台,唯一已知的情況是接續的體細胞雜交。

        簡單、經濟的質控措施能夠阻止或至少會減少細胞錯誤鑒定的發生。由于缺乏重視及未采用質控措施導致細胞錯誤鑒定現象極其普遍。大量質控措施的實行以及相應文件的適當調整被認為是生物制藥領域出現相對較低細胞錯誤鑒定報道的因素。

        交叉污染檢測

        許多方法已被用來檢測交叉污染,包括同工酶分析真人网上投注平台、核型分析、人類白細胞抗原(HLA)分型,免疫分型和DNA指紋識別。這些方法都可以鑒別出某一種細胞系真人网上投注平台,但是分辨能力各不一樣真人网上投注平台真人网上投注平台。然而,這些方法在不同實驗室所得到的數據卻不盡相同,以致沒有任何一種方法可以用來建立一個標準參考數據庫真人网上投注平台。

        許多實驗室利用STR分型來鑒定人源細胞系。STR分型是一種用來做親緣分析的方法,它的原理是在一單管中同時擴增多個多態性DNA片段。STR位點是由不同數目重復單元組成的重復DNA序列。每一個STR位點均能被擴增且擴增產物標記上不同顏色的熒光,使得擴增產物很容易通過片段大小和顏色來區分。STR分型快速、經濟、易于自動化,能得到可重復的數據真人网上投注平台,且數據格式適合建立一個標準參考數據庫。由于快速、鑒定的細胞系結果明確真人网上投注平台,STR分型的應用價值最大。

        STR分型——潛力及局限

        3-5個堿基重復的DNA重復序列已常規性地用來做親緣鑒定真人网上投注平台、法醫鑒定真人网上投注平台、以及鑒定在20年之前的大災難中遇難的受害者。隨后,STR分型用于細胞鑒定中。用STR分型來做細胞鑒定有幾大優勢。

        腫瘤細胞系包含許多遺傳改變,因此用STR分型來分析腫瘤細胞系的標準必須與正常組織不一(見補充信息Box3)。腫瘤細胞通常會表現出雜合性丟失(即缺失一個等位基因以致難以與純合子相區分),另外由于DNA復制,腫瘤細胞可攜帶等位基因的多個拷貝真人网上投注平台。與此類似,在腫瘤細胞培養過程中,腫瘤細胞系既可失去等位基因的一個拷貝,也可偶爾獲得一個拷貝。所以,相同細胞系的亞系可能會含有不同的STR分型。

        對比相同的等位基因,已往發表的數據表明真人网上投注平台,75%的一致性已能鑒別出所有已知的交叉污染細胞系,一致性超過50%的兩個細胞系不會認為是來源于不同個體,因此,在單一細胞系和存在交叉污染的細胞系之間存在25%的“緩沖區”,任何細胞系只要一致性水平在50%和75%之間,它就應該認為是可疑的。

        在分析人類細胞系基因型中,其主要的問題包括雜合子峰高不平衡(即一等位基因的峰高或面積遠大于另一等位基因)、某一基因座出現多個等位基因、等位基因丟失(目的片段未能擴增)。由于腫瘤細胞系為非整倍體,所以其雜合子峰高不平衡以及在一個或多個基因座出現多個等位基因的現象非常典型真人网上投注平台。

        基因分型所需費用是大家主要關心的問題,但是相對于細胞系的整個工作來講其費用就微不足道了。STR分型的費用包括DNA提取、STR 位點的PCR擴增、毛細管電泳分離擴增片段和數據分析。增加STR基因座的數目如從6個到15個將會達到一個非常高的分辨率。

        STR分型存在一個大的局限真人网上投注平台,就是它不能檢測來源于其他物種的污染細胞,哪怕是人類細胞被過生長的其它物種細胞所覆蓋真人网上投注平台,用人類或高等靈長類特異性引物也不會有DNA擴增。在PCR中采用用物種特異性引物可以用來檢測來源于其它物種的污染細胞。如果應用于其它物種的STR分型已被建立(目前局限于少數幾個具有重要商業價值的物種)真人网上投注平台,STR分型無疑可被用來鑒定污染細胞。

        對于大部分已被建立的細胞系,供體組織已不能獲得,那些被廣泛使用的細胞系其最初來源者要么退休要么已辭世。在這些情況下,一種基于儲存于細胞庫中可能是最老的細胞群假想出現了。這些分型將需要標記上“臨時”來指示缺乏對最初供體組織的分型鑒定。

        在下面描述的數據庫可用之前,能用來對比STR分型的可用資源極為有限真人网上投注平台。ATCC和DSMZ細胞庫網站真人网上投注平台,以及CLIMA(細胞系分子鑒定整合數據庫)提供了一些信息,至少兩種系列的STR分型數據已公布真人网上投注平台。目前,最有用的資源之一是Amanda Capes-Davis 和Ian Freshney收集的錯誤鑒定細胞系清單,這在歐洲細胞培養物收藏所(ECACC)網站上也可查看。所有的科研工作者都應對照這一清單來核對他們正在使用的細胞系名稱。

        交互式數據庫

        有人提議建立一個旨在開發可用STR分型數據的數據庫,這些數據可作為人類細胞系鑒定的數據真人网上投注平台。交互式數據庫任何人都可進入,但只有數據庫管理員才能對數據進行修改或補充真人网上投注平台。這個數據庫不僅提供DNA分型,還能允許實驗室將他們的細胞系STR分型數據與數據庫里的細胞系數據相比較,這樣便于確保實驗數據的可靠性。

        通用標準是組成一個好的數據庫的必備條件,應用細胞鑒定的標準可以建立起一個由每一個有確定STR分型的單一細胞系組成的交互式數據庫真人网上投注平台,并為STR分型檢測以及分析提供必備條件。標準制定委員會的成員將會與NCBI協作開發交互式數據庫所需要的條件,數據庫由NCBI維護。數據庫最初只包含科研人員常用的并保存在大型細胞庫的500個已證實的細胞系。

        每一個細胞系在被提交至數據庫之前都會確定其STR分型。比對STR分型數據最有效的數據庫會由一組常見的標記物組成真人网上投注平台。然而,并不是所有的數據都是收集相同的STR位點或是用同一代的測序儀器得到的真人网上投注平台。針對相同的STR標記使用不用引物組合是法醫和人身份鑒定中的慣例,美國的聯邦調查局聯合DNA索引系統(CODIS)就是采用13個核心STR位點組合來錄入數據的。為了能維持進入CODIS的數據之間的整合,各實驗室必須使用CODIS認可的STR分型試劑盒和儀器,并且嚴格按照質量保證標準來操作。CODIS認可的試劑盒已經歷了大量的驗證研究,包括旨在解釋使用不同引物組合時出現STR分型差別的一致性研究真人网上投注平台。相同的程序會是細胞STR分型所必需的。

        未來

        從增加的數據可信性真人网上投注平台、只需很少的時間和費用真人网上投注平台,以及研究被錯誤鑒定的細胞系的所花費的精力來看,細胞系STR分型鑒定將會在科學研究中產生重大影響。細胞系的精確鑒定在研發基于細胞下的醫學產品起到至關重要的作用,它能避免將人體細胞暴露于錯誤鑒定細胞中的風險。盡管這種錯誤鑒定大部分可以通過遵循質控措施而避免,例如正確標記真人网上投注平台、在生產基于細胞的醫學產品時采取跟蹤計劃,但是當用來證實一個來源于預期供體的細胞產品以及它被有意地與其它供體細胞混合時真人网上投注平台,利用可明確鑒定細胞和組織的標準方法將會提供安全保障。這個問題對于個體化醫療和應用基于干細胞的技術(包括誘導多能干細胞)非常重要。

        沒有一個單一的方法可提供所有的信息來鑒定一個人類細胞系。STR分型是這一時期的最佳代表真人网上投注平台,因此真人网上投注平台,隨著新信息的可用,STR分型標準將會不斷地改進。向任何人開放的交互式、可搜尋的數據庫將會大大減低錯誤鑒定細胞的使用率?;鸩块T和期刊也被鼓勵采取對使用錯誤鑒定細胞“零容忍”的政策并要求作者提供證據以支持其使用的為正確的細胞系。

         

        文獻來源Cell line misidentification: the beginning of the endNat Rev Cancer, 2010. 10(6): p. 441-8.

         

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